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Black rat used in an experiment

Tierversuche zum Test neuer Materialien und Substanzen

Jegliche Produkte, die für die Nutzung durch den Menschen vorgesehen sind oder mit denen der Mensch potentiell in Berührung kommen könnte, werden auf ihre biologische Verträglichkeit getestet. In Bioverträglichkeitstests wird untersucht, welche Wirkung bestimmte Substanzen auf biologische Systeme haben, damit Schäden für den Menschen ausgeschlossen werden können. Hier spielen Interessen der Industrie, der biomedizinischen Forschung als auch der Biomaterialforschung zu medizinischen Zwecken eine Rolle. Zu den typischerweise getesteten Biomaterialien zählen zum Beispiel Materialien für Bypass-Operationen, Herzschrittmacher, die Unfallchirurgie und zahnärztliche Eingriffe. Des Weiteren kommen solche Tests auch für nicht-medizinische Materialien wie Plastik zum Einsatz, welches für die Herstellung von Flaschen, Tüten und anderen Gebrauchsgegenständen genutzt wird. Auch andere, in der Industrie genutzte Materialien werden getestet, wenn ihre Auswirkungen auf den Menschen nicht oder nur teilweise bekannt sind.

In der Vergangenheit wurden neue Materialien oder Substanzen in Hinblick auf ihre biologische Verträglichkeit immer an Menschen getestet. Heutzutage gilt dieses Verfahren jedoch als inakzeptabel. Damit Substanzen als biologisch verträglich eingestuft werden können, müssen sie mehrere Testphasen durchlaufen haben. Zu diesen Phasen zählen In-vitro-Tests, In-vivo-Tests sowie In-Use-Tests bzw. klinische Tests. In all diesen Testphasen kommen verschiedene Testverfahren zum Einsatz, was Anlass zu einer Reihe von ethischen Fragen gibt.

 

Testmethoden

In-vitro-Tests

In-vitro-Tests werden nicht an lebenden Organismen, sondern an Zellen, Geweben und Organen durchgeführt, [welche sich in Reagenzgefäßen und/oder Petrischalen befinden]. Allerdings werden im Rahmen dieser Versuche auch Tiere getötet oder zumindest verletzt, wenn ihnen Gewebe, Organe oder andere Körperteile zur Nutzung in den Tests entfernt werden.

In-vivo-Tests

Die Bezeichnung „in vivo“ (lateinisch für „im Lebendigen“) beschreibt bereits deutlich, dass diese Tests an lebendigen Tieren durchgeführt werden. Dabei werden die Tiere einem direkten Kontakt mit den Testsubstanzen ausgesetzt. Die Applikation der Substanzen kann subkutan (unter die Haut), intramuskulär (in die Muskeln), intravaskulär (in ein Blut- oder Lymphgefäß) oder in die Knochen erfolgen. Oft werden In-vivo-Tests selbst nach Markteinführung des Produkts regelmäßig wiederholt, damit in vorigen Studien eventuell übersehene Probleme nicht unbemerkt bleiben oder neue Anwendungsbereiche oder Änderungen an der Substanz getestet werden können.

In-Use-Tests und klinische Tests

Im Unterschied zu In-vivo-Tests wird bei In-Use-Tests die Substanz immer unter den gleichen Bedingungen getestet wie bei der späteren tatsächlichen Anwendung. Deshalb werden für diese Tests nichtmenschliche Tiere gewählt, die in physiologischer Hinsicht eine große Ähnlichkeit zum Menschen aufweisen, wie beispielsweise Hunde und Affen (im Gegensatz zu Nagetieren). Am Menschen durchgeführte In-Use-Tests werden in der Regel als klinische Tests bezeichnet. Theoretisch handelt es sich bei beiden Formen um das gleiche Testverfahren. In der Praxis gibt es jedoch einen Unterschied: Die Menschen werden in solchen Tests mit Respekt behandelt und möglichst minimalen Risiken ausgesetzt. Bei nichtmenschlichen Tieren ist dies nicht der Fall; sie werden ohne Rücksichtnahme auf ihr Wohl so behandelt, wie es dem Menschen gerade passt – ob sie Schmerzen erleiden, interessiert kaum jemanden. Immer wieder kommt es auch dazu, dass sie getötet werden, obwohl das Töten der Tiere nach Durchführung der Tests rein gar nichts mit den Tests selbst zu tun hat.

 

Verfahren zum Test neuer Wirkstoffe

Im Rahmen der einzelnen Testverfahren wird den Tieren Schmerz und Leid zugefügt, oft werden sie sogar getötet. Zu den Standardtests zählen unter anderen die folgenden:

Schleimhaut-Reizungstests

In diesen Tests wird untersucht, ob durch eine bestimmte Substanz eine Entzündung der Schleimhaut hervorgerufen wird. Zum Testbeginn wird die potentiell reizende Substanz auf die Schleimhaut aufgetragen oder in die Schleimhaut injiziert. Nach einigen Wochen werden die Tiere fotografiert und anschließend getötet, damit histologische (mikroskopische) Untersuchungen am Gewebe vorgenommen und Entzündungsreaktionen auf den Teststoff festgestellt werden können.

Hautempfindlichkeitstests

In Hautempfindlichkeitstests soll festgestellt werden, ob eine Substanz nach Injektion in die Haut Entzündungen verursacht. Die Stärke der Reaktionen und der prozentuale Anteil an Tieren, die eine Reaktion aufweisen, stellen die Grundlage für die Schätzung der Allergenität der Substanz dar.

Zahnverträglichkeitstests

Diese Tests ähneln den Hautempfindlichkeitstests. Hier wird jedoch die biologische Verträglichkeit mit dem Zahnmark anstatt mit der Haut getestet.

Zellmembrandurchlässigkeitstests

Eine andere Methode zur Messung der Zytotoxizität, also der Fähigkeit chemischer Substanzen, Zellen und Gewebe zu schädigen, besteht darin, Veränderungen der Zellmembrandurchlässigkeit zu messen. Um die Messungen und Zellidentifikation zu erleichtern, werden die Zellen dabei mit Farbstoffen gefärbt.

Tests mit Barrierestoffen

In diesen Tests wird eine Substanz in vitro (in einem Reagenzgefäß) getestet, wobei zwischen der Testsubstanz und den Zellen eine Barriere hinzugefügt wird. Als solche Barrieren dienen zum Beispiel pflanzliche Polymere wie Agar-Agar (ein aus Rotalgen extrahiertes Geliermittel). Durch die Barrieresubstanz wird ein Kontakt zwischen der Testsubstanz und den Zellen verhindert. So soll möglichst genau nachgestellt werden, welche Vorgänge in einem lebendigen Organismus stattfinden. Dadurch lassen sich die Erkenntnisse aus entsprechenden Studien besser auf die Realität unter klinischen Bedingungen anwenden.

Zellwachstumstests

Ziel dieser Verfahren ist die Bestimmung der Anzahl an Zellen, die infolge der Verabreichung der Testsubstanz gewachsen sind. Die Testsubstanz wird direkt auf die Zellkultur in eine Schale gegeben. Im Falle von zytotoxischen (zellschädigenden) Substanzen kommt es bei den betroffenen und umgebenden Zellen zu keinem Wachstum. Ergebnisse der Zelldichtenmessung zur Bestimmung der biologischen Verträglichkeit können qualitativ, semi-qualitativ oder quantitativ beschrieben werden. Dabei wird das antimikrobielle Potential bestimmter Substanzen gegen pathogene (krankheitserregende) Mikroorganismen gemessen. Die Anzahl der durch die Testsubstanz abgetöteten Zellen dient als Maßstab für die Zytotoxizität der Substanz.

Enzymatische Biosynthese

In diesen Tests werden Veränderungen der DNA gemessen, um den Effekt einer Substanz auf die Proteinsynthese zu ermitteln. Die Vorläuferzellen werden mit Radioisotopen (radioaktiven Stoffen) markiert und einer Zellkultur hinzugefügt. Anschließend wird analysiert, welche Vorläuferzellen DNA und Proteine synthetisieren.

Ames-Test

Bei dieser In-vitro-Testmethode wird eine Substanz oder chemische Verbindung auf ihre Mutagenität getestet, also in welchem Maße sie Mutationen in den benachbarten Zellen auslöst. Da auch Krebserkrankungen durch Beschädigung der DNA verursacht werden, wird diese Methode auch zur Feststellung des krebserzeugenden Potentials einer Verbindung angewandt.

Im Ames-Test wird die Fähigkeit eines potentiellen Mutagens zum Auslösen von Mutationen in einem Stamm modifizierter Salmonella tymphimurium Bakterien getestet. Unter normalen Umständen können diese Bakterien die Aminosäure Histidin herstellen. Im Rahmen des Tests werden jedoch Bakterien mit einer isolierten Mutation in den für die Histidin-Synthese verantwortlichen Genen verwendet, sodass die Synthese verhindert wird.1

Üblicherweise wird den Histidin-abhängigen Bakterien zu Testbeginn Rattenleberextrakt hinzugefügt, damit die Stoffwechselzustände von Säugetieren so gut wie möglich nachgeahmt werden können. Mittlerweile ist auch die Verwendung von Extrakten der menschlichen Leber statt Rattenleber möglich.

Da Histidin für die Bakterien eine essentielle Aminosäure bildet und diese im Teststamm nicht hergestellt werden kann, bleibt den Bakterien nur eine Möglichkeit zum Überleben: Sie müssen mutieren, sodass sie in der Lage sind, Histidin herzustellen. Beim Ames-Test wird somit die Fähigkeit neuer Substanzen getestet, Mutationen auszulösen.

Während des Tests werden die Bakterien über eine Agarplatte mit einer kleinen Menge an Histidin verteilt, sodass sie überleben und sich vermehren können – allerdings nur für eine kurze Zeit, bis die Aminosäure aufgebraucht ist. Anschließend werden sie für weitere 48 Stunden dem Kontakt mit den potentiellen Mutagenen ausgesetzt. Bakterien, die in dieser Zeit überleben und sich vermehren, sind dazu nur fähig, weil sie mutiert sind und Histidin herstellen können. Die Anzahl der Bakterienkolonien in der Endphase wird mit der Anzahl der Bakterienkolonien in einem Kontrollstamm ohne potentielle Mutagene verglichen. Die Effektivität der potentiellen Mutagene in Hinblick auf das Auslösen von Mutationen wird proportional zur Anzahl der Kolonien am Ende des Tests betrachtet. Eine große Anzahl an Bakterienkolonien deutet auf ein hohes Potential zum Auslösen von Mutationen hin.

Styles-Test

Dieser Test ähnelt dem Ames-Test; allerdings werden hier Zellen von Säugetieren anstatt von Bakterien verwendet.

 

Testmodelle

In der Vergangenheit entsprach der Standardprozess zum Test der biologischen Verträglichkeit neuer Substanzen einer festen Struktur, die sich pyramidenförmig darstellen lässt. Die erste Stufe bilden In-vitro-Tests, die nicht unbedingt Erkenntnisse für die letztendliche Anwendung der Substanz liefern.2 Darauf folgen In-vivo-Tests mit Tieren und zuletzt In-Use-Tests bzw. klinische Tests. Die zweite Stufe erreichen nur Substanzen, die bereits die erste Stufe erfolgreich durchlaufen haben. Die pyramidale Struktur ergibt sich daraus, dass in der ersten Stufe alle Substanzen getestet werden. Davon werden einige aussortiert, sodass in der zweiten Stufe weniger Substanzen getestet werden.

Die ersten Tests im Rahmen dieses Modells lassen jedoch nicht immer Aussagen über die Wirkung der Substanzen unter realen Bedingungen zu. Deshalb sind weitere Tests in der letzten Stufe (In-Use- bzw. klinische Tests) notwendig.

Auch heutzutage ist das Pyramidenmodell noch üblich, wenn auch weniger strikt angewendet. Das liegt daran, dass die Tests der ersten beiden Stufen (In-vitro- und In-vivo-Tests mit Tieren) als weniger wichtig erachtet werden als zuvor. Darüber hinaus besteht heute ein größerer Zusammenhang zwischen der Forschung auf den einzelnen Ebenen. Anstatt einer klaren Unterteilung in drei Stufen wird der Prozess als Ganzes gesehen. Die verschiedenen Testmethoden sind Teil eines fortlaufenden Prozesses, der sich im Zuge der klinischen Erfahrung mit neuen Substanzen weiterentwickelt.

Außerdem hat zunehmendes Engagement für tierfreie Testmethoden zu einem Anstieg der In-vitro-Tests geführt. Das strikte Pyramidenmodell, in dem In-vivo-Tests ein fester Bestandteil waren, lockert sich zunehmend auf, da aufgrund neuer Entwicklungen bei den In-vitro-Tests die Bedingungen in lebenden Organismen besser simuliert werden können, obwohl hier nach wie vor tierische Bestandteile wie Gewebe und Organextrakte genutzt werden.3 Auch bei der Nutzung von Barrieresubstanzen für bestimmte Tests, Zellkulturen und Gewebe hat es Fortschritte gegeben. Darüber hinaus wurden die Teststandards durch Fortschritte in der Identifizierung klinisch relevanter biologischer Marker verbessert, wie Veränderungen in der DNA-Transkription4 oder dem Auftreten von bestimmten Substanzen, anhand derer die biologischen Effekte einer Testsubstanz gemessen werden können.5

Heutzutage werden die drei Methoden zum Test der biologischen Verträglichkeit oft simultan durchgeführt. Zum Beispiel kann in einem In-vitro-Test eine bestimmte biologische Reaktion untersucht werden, die während klinischer Tests festgestellt wurde, oder ein solcher Test wird nach der Markteinführung der Substanz durchgeführt.


Literaturhinweise

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Tannenbaum, J. & Rowan, A. N. (1985) „Rethinking the morality of animal research“, Hastings Center Report, 15 (5), pp. 32-43 [letzter Zugriff: 17. April 2013].


1 Die Originalartikel, in denen diese Methode angesprochen wird, wurden vor vierzig Jahren veröffentlicht. Siehe: Ames, B. N.; McCann, J. & Yamasaki, E. (1975) „Methods for detecting carcinogens and mutagens with the salmonella/mammalian-microsome mutagenicity yest“, Mutation Research, 31, pp. 347-364. Maron, D. M. & Ames, B. N. (1983) „Revised methods for the salmonella mutagenicity test“, Mutation Research, 113, 173-215.

2 Es gibt verschiedene Arten von In-vitro-Tests, die in Reagenzgläsern, Petrischalen oder ähnlichen Utensilien durchgeführt und daher auch als „Reagenzglastests“ bezeichnet werden. Zum Beispiel werden zum Test der biologischen Verträglichkeit von Verbandsmaterialien Zellen in Agarose (ein Polysaccharid, das aus Algen gewonnen wird) gegeben und durch andere Chemikalien aufgespalten, damit die DNA freigegeben wird. Daraufhin werden die Materialien auf ihre Genotoxizität untersucht. Siehe: Keong, L. C. & Halim, A. S. (2009) „In vitro models in biocompatibility assessment for biomedical-grade chitosan derivatives in wound management“, International Journal of Molecular Science, 10, pp. 1300-1313 [letzter Zugriff: 22. April 2013].

3 Jessen, B. A.; Mullins, J. S.; de Peyster, A. & Stevens, G. J. (2003) „Assessment of hepatocytes and liver slices as in vitro test systems to predict in vivo gene expression“, Toxilogical Sciences, 75, pp. 208-222 [letzter Zugriff: 22. April 2013].

4 Johansson, H.; Lindstedt, M.; Albrekt, A.-S. & Borrebaeck, C. A. K. (2011) „A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternativeto animal tests“, BMC Genomics, 12, p. 399 [letzter Zugriff: 26. November 2012].

5 Orfeas L.; Tighiouart, H.; Perianayagam, M.; Kolyada, A.; Han, W. K.; Wald, R.; Bonventre, J. V. & Jaber, B.L. (2009) „Comparative analysis of urinary biomarkers for early detection of acute kidney injury following cardiopulmonary bypass“, Biomarkers, 14, pp. 423-431 [letzter Zugriff: 26. September 2012].

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